SPEKTROFOTOMETRI
Spektrofotometri merupakan salah satu metode dalam kimia analisis yang
digunakan untuk menentukan komposisi suatu sampel baik secara kuantitatif dan
kualitatif yang didasarkan pada interaksi antara materi dengan cahaya.
Peralatan yang digunakan dalam spektrofotometri disebut spektrofotometer. Cahaya yang dimaksud dapat berupa cahaya visibel, UV dan
inframerah, sedangkan materi dapat berupa atom dan molekul namun yang lebih
berperan adalah elektron valensi.
Sinar atau cahaya yang berasal dari sumber tertentu disebut juga sebagai
radiasi elektromagnetik. Radiasi elektromagnetik yang dijumpai dalam kehidupan
sehari-hari adalah cahaya matahari.
Dalam interaksi materi dengan cahaya atau radiasi elektromagnetik, radiasi
elektromagnetik kemungkinanan dihamburkan, diabsorbsi atau dihamburkan sehingga
dikenal adanya spektroskopi hamburan, spektroskopi absorbsi ataupun
spektroskopi emisi.
Pengertian spektroskopi dan spektrofotometri pada dasarnya sama yaitu di
dasarkan pada interaksi antara materi dengan radiasi elektromagnetik. Namun
pengertian spektrofotometri lebih spesifik atau pengertiannya lebih sempit
karena ditunjukan pada interaksi antara materi dengan cahaya (baik yang dilihat
maupun tidak terlihat). Sedangkan pengertian spektroskopi lebih luas misalnya
cahaya maupun medan magnet termasuk gelombang elektromagnetik.
Radiasi elektromagnetik memiliki sifat ganda yang disebut sebagai sifat
dualistik cahaya yaitu:
1) Sebagai
gelombang
2) Sebagai
partikel-partikel energi yang disebut foton.
Karena sifat tersebut maka beberapa parameter perlu diketahui misalnya panjang
gelombang, frekuensi dan energi tiap foton. Panjang gelombang (l) didefinisikan
sebagai jarak antara dua puncak.
Hubungan dari ketiga parameter di atas dirumuskan oleh Planck yang dikenal
dengan persamaan Planck. Hubungan antara panjang gelombang
frekuensi dirumuskan sebagai
c
= λ . v atau λ = c/v atau v = c/λ
Persamaan
Planck: hubungan antara energi tiap foton dengan frekuensi
E = h . v
E = h . c/ λ
dimana
E = energi tiap foton
h = tetapan Planck (6,626 x 10-34 J.s),
v = frekuensi sinar
c = kecepatan cahaya (3 x 108 m.s-1).
Dari
rumus di atas dapat diketahui bahwa energi dan frekuensi suatu foton akan
berbanding terbalik dengan panjang gelombang tetapi energi yang dimiliki suatu
foton akan berbanding lurus dengan frekuensinya.
Misalnya: energi yang dihasilkan cahaya UV lebih besar dari pada energi
yang dihasilkan sinar tampak.
Hal ini disebabkan UV memiliki panjang gelombang (λ) yang lebih pendek (100–400
nm) dibanding panjang gelombang yang dimiliki sinar tampak (400–800 nm).
Interaksi antara
materi dengan cahaya disini adalah terjadi penyerapan cahaya, baik cahaya Uv,
Vis maupun Ir oleh materi sehingga spektrofotometri disebut juga sebagai spektroskopi
absorbsi.
Dari 4 jenis spektrofotometri ini (UV, Vis, UV-Vis dan Ir) memiliki prinsip
kerja yang sama yaitu “adanya interaksi antara materi dengan cahaya yang
memiliki panjang gelombang tertentu”. Perbedaannya terletak pada panjang
gelombang yang digunakan.
Secara sederhana
Instrumen spektrofotometri yang disebut spektrofotometer terdiri dari :
sumber
cahaya – monokromator – sel sampel – detektor – read out (pembaca).
Fungsi masing-masing bagian:
1. Sumber sinar polikromatis berfungsi sebagai sumber
sinar polikromatis dengan berbagai macam rentang panjang gelombang. Untuk
sepktrofotometer
- UV menggunakan lampu deuterium atau disebut juga heavi hidrogen
- VIS menggunakan lampu tungsten yang sering disebut lampu wolfram
- UV-VIS menggunan photodiode yang telah dilengkapi monokromator.
- Infra merah, lampu pada panjang gelombang IR.
2. Monokromator berfungsi sebagai penyeleksi panjang
gelombang yaitu mengubah cahaya yang berasal dari sumber sinar polikromatis
menjadi cahaya monaokromatis. Jenis monokromator yang saat ini banyak digunakan
adalan gratting atau lensa prisma dan filter optik.
Jika digunakan grating maka cahaya akan dirubah
menjadi spektrum cahaya. Sedangkan filter optik berupa lensa berwarna sehingga
cahaya yang diteruskan sesuai dengan warnya lensa yang dikenai cahaya. Ada
banyak lensa warna dalam satu alat yang digunakan sesuai dengan jenis
pemeriksaan.
Pada gambar di
atas disebut sebagai pendispersi atau penyebar cahaya. dengan adanya
pendispersi hanya satu jenis cahaya atau cahaya dengan panjang gelombang
tunggal yang mengenai sel sampel. Pada gambar di atas hanya cahaya hijau yang
melewati pintu keluar. Proses dispersi atau penyebaran cahaya seperti yang
tertera pada gambar.
3. Sel sampel
berfungsi sebagai tempat meletakan sampel
- UV, VIS dan UV-VIS
menggunakan kuvet sebagai tempat sampel. Kuvet biasanya terbuat dari kuarsa
atau gelas, namun kuvet dari kuarsa yang terbuat dari silika memiliki kualitas
yang lebih baik. Hal ini disebabkan yang terbuat dari kaca dan plastik dapat
menyerap UV sehingga penggunaannya hanya pada spektrofotometer sinar tampak
(VIS). Cuvet biasanya berbentuk persegi panjang dengan lebar 1 cm.
- IR, untuk sampel
cair dan padat (dalam bentuk pasta) biasanya dioleskan pada dua lempeng natrium
klorida. Untuk sampel dalam bentuk larutan dimasukan ke dalam sel natrium
klorida. Sel ini akan dipecahkan untuk mengambil kembali larutan yang
dianalisis, jika sampel yang dimiliki sangat sedikit dan harganya mahal.
4. Detektor
berfungsi menangkap cahaya yang diteruskan dari sampel dan mengubahnya menjadi
arus listrik. Syarat-syarat sebuah detektor :
·
Kepekaan yang tinggi
·
Perbandingan isyarat atau signal
dengan bising tinggi
·
Respon konstan pada berbagai
panjang gelombang.
·
Waktu respon cepat dan signal
minimum tanpa radiasi.
- Signal listrik yang dihasilkan harus sebanding dengan tenaga radiasi.
Macam-macam detektor :
·
Detektor foto (Photo detector)
·
Photocell, misalnya CdS.
·
Phototube
·
Hantaran foto
·
Dioda foto
·
Detektor panas
5. Read out
merupakan suatu sistem baca yang menangkap besarnya isyarat listrik yang
berasal dari detektor.
Proses
Absorbsi Cahaya pada Spektrofotometri
Ketika cahaya dengan panjang berbagai panjang gelombang (cahaya polikromatis)
mengenai suatu zat, maka cahaya dengan panjang gelombang tertentu saja yang
akan diserap. Di dalam suatu molekul yang memegang peranan penting adalah
elektron valensi dari setiap atom yang ada hingga terbentuk suatu materi.
Elektron-elektron yang dimiliki oleh suatu molekul dapat berpindah (eksitasi),
berputar (rotasi) dan bergetar (vibrasi) jika dikenai suatu energi.
Jika zat menyerap cahaya tampak dan UV maka akan terjadi perpindahan elektron
dari keadaan dasar menuju ke keadaan tereksitasi. Perpindahan elektron ini
disebut transisi elektronik. Apabila cahaya yang diserap adalah
cahaya inframerah maka elektron yang ada dalam atom atau elektron ikatan pada
suatu molekul dapat hanya akan bergetar (vibrasi). Sedangkan gerakan berputar
elektron terjadi pada energi yang lebih rendah lagi misalnya pada gelombang
radio.
Atas dasar inilah spektrofotometri dirancang untuk mengukur konsentrasi suatu
suatu yang ada dalam suatu sampel. Dimana zat yang ada dalam sel sampel
disinari dengan cahaya yang memiliki panjang gelombang tertentu. Ketika cahaya
mengenai sampel sebagian akan diserap, sebagian akan dihamburkan dan sebagian
lagi akan diteruskan.
Pada spektrofotometri, cahaya datang atau cahaya masuk atau cahaya yang
mengenai permukaan zat dan cahaya setelah melewati zat tidak dapat diukur, yang
dapat diukur adalah It/I0 atau I0/It (perbandingan
cahaya datang dengan cahaya setelah melewati materi (sampel)). Proses
penyerapan cahaya oleh suatu zat dapat digambarkan sebagai berikut:
Gambar Proses
penyerapan cahaya oleh zat dalam sel sampel. dari gambar terlihat bahwa zat
sebelum melewati sel sampel lebih terang atau lebih banyak di banding cahaya
setelah melewati sel sampel.
Spektrofotometer UV-VIS
Spektrofotometri
Sinar Tampak (UV-Vis) adalah pengukuran energi cahaya oleh suatu sistem kimia
pada panjang gelombang tertentu (Day, 2002). Sinar ultraviolet (UV) mempunyai
panjang gelombang antara 200-400 nm, dan sinar tampak (visible) mempunyai
panjang gelombang 400-750 nm. Pengukuran spektrofotometri menggunakan alat
spektrofotometer yang melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada
molekul yang dianalisis, sehingga spektrofotometer UV-Vis lebih banyak dipakai
untuk analisis kuantitatif dibandingkan kualitatif. Spektrum UV-Vis sangat
berguna untuk pengukuran secara kuantitatif. Konsentrasi dari analit di dalam
larutan bisa ditentukan dengan mengukur absorban pada panjang gelombang
tertentu dengan menggunakan hukum Lambert-Beer (Rohman, 2007).
Hukum
Lambert-Beer menyatakan hubungan linieritas antara absorban dengan konsentrasi
larutan analit dan berbanding terbalik dengan transmitan. Dalam hukum
Lambert-Beer tersebut ada beberapa pembatasan, yaitu :
- Sinar yang digunakan dianggap monokromatis
- Penyerapan terjadi dalam suatu volume yang
mempunyai penampang yang sama
- Senyawa yang menyerap dalam larutan tersebut
tidak tergantung terhadap yang lain
dalam larutan tersebut
- Tidak terjadi fluorensensi atau fosforisensi
- Indeks bias tidak tergantung pada
konsentrasi larutan
Hukum
Lambert-Beer dinyatakan dalam rumus sbb :
A
= e.b.c
dimana :
A = absorban
e = absorptivitas molar
b = tebal kuvet (cm)
c = konsentrasi
Spektrofotometri UV-Vis serta Aspek
Kualitatif dan Kuantitatifnya
Saya
akan membahas tentang beberapa hal mengenai spektrofotometri. Spektrofotometri
merupakan salah satu materi yang terdapat pada kimia analisis. Artikel ini Saya
buat untuk memudahkan Saya dalam belajar dan memperdalam mengenai kimia
analisis, berhubung ini adalah ketiga kalinya Saya mengambil mata kuliah ini.
Beberapa hari yang lalu, dosen Saya masuk ke kelas dan mengumumkan bahwa materi
yang akan masuk dalam ujian final adalah seputar spektrofotometri serta
analisis kualitatif dan kuantitatifnya. Adapun yang menjadi acuan pustaka Saya
adalah sedikit catatan kuliah dan buku Kimia Analisis Farmasi karangan Prof.
Dr. Ibnu Gholib Gandjar, DEA.,Apt. dan Abdul Rohman, M.Si.,Apt.
Pada
spektrofotometri digunakan alat yang disebut dengan spketrofotometer. Adapun
prinsipnya menggunakan radiasi elektromagnetik (REM) yakni sinar yang digunakan
pada sinar Ultraviolet dan sinar visible dapat dianggap sebagai energi yang
merambat dalam bentuk gelombang. Adapun yang diukur pada spektrofotometri
adalah nilai absorban (A) yakni adanya absorbsi pada panjang gelombang maksimum
yang kemudian dihitung konsentarsinya. Metode ini disebut metode basah karena
sampel yang digunakan adalah larutan dimana harus diketahui batas konsentrasi
terkecil sampel yang diukur.
Perlu
diketahui terlebih dahulu, bahwa panjang gelombang adalah jarak linier dari
suatu titik pada satu gelombang ke titik yang bersebelahan pada panjang
gelombang berdekatan. Dimensi panjang gelombang adalah panjang (L) yang dapat
dinyatakan dalam centimeter (cm), angstrom (Å), atau nanometer (nm).
Frekuensi
merupakan banyaknya gelombang yang melewati suatu titik tertentu dalam satuan
waktu. Dimensi frekuensi adalah T-1 dan satuan yang biasa digunakan adalah
detik-1.
Sinar
UV memiliki panjang gelombang = 200-400 nm sedangkan sinar visibel memiliki panjang
gelombang = 400-750 nm. Berikut ini adalah tabel kisaran panjang gelombang,
frekuensi, dan spektrum elektromanetik.
Penyerapan
Radiasi oleh Molekul
Semua
molekul mempunyai komponen energi yang terdiri dari :
1. Translasi ; molekul secara keseluruhan
dapat bergerak. Energi yang ada hubungannya dengan tranlasi disebut energi
tranlasional (Etrans).
2. Vibrasi ; gerakan bagian molekul (atom
atau sekelompok atom) yang dapat bergerak karena berhubungan satu sama lain.
Energi yang berhubungan dengan vibrasi disebut dengan energy vibrasional
(Evibr)
3. Rotasional ; molekul dapat berotasi pada
sumbunya. Energinya disebut energy rotasional (Erot)
4. Elektronik ; suatu molekul yang memiliki
konfigurasi elektronik yang tergantung pada elektronik molekul dan energinya
disebut energi elektronik (Eelek).
Bila
dirumuskan maka energi suatu molekul adalah gabungan dari beberapa komponen di
atas.
E
= Etrans + Evibr + Erot + Eelek
Aspek
Kualitatif dan Kuantitatif Spektrofotometri UV-Vis
Spekra
UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan sekaligus dapat digunakan
untuk analisis kuantitatif.
1.
Aspek Kualitatif ;
Data
spektra UV-Vis bila digunakan secara tersendiri, tidak dapat digunakan unutk
identifikasi kualitatif obat atau metabolitnya. Akan tetapi, bila digabung
dengan cara lain seperti spektroskopi infra merah, resonansi magnet inti, dan
spektroskoppi massa, maka dapat digunakan untuk maksud analisis kualitatif
suatu senyawa tersebut.
Data
yang diperoleh dari spektroskopi UV dan Vis adalah panjang gelombang maksimal,
intensitas, efek, pH, dan pelarut yang kesemuanya dapat dibandingkan dengan
data yang sudah dipublikasikan.
Dari
spektra yang diperoleh dapat dilihat, misalnya :
a.
Serapan (absorbansi) berubah atau tidak karena perubahan pH. Jika berubah bagaimana perubahannya apakah
batokromik ke hipsokromik dan sebaliknya atau dari hipokromik ke hiperkromik,
dsb.
b.
Obat-obat yang netral misalnya kafein, kloramfenikol atau obat-obat yang berisi
ausokrom yang tidak terkonjugasi seperti amfetamin, siklizin, dan pensiklidin.
2.
Aspek Kuantitatif ;
Suatu
berkas radiasi dikenakan pada larutan sampel (cuplikan) dan intensitas sinar
radiasi yang diteruskan diukur besarnya.
Intensitas atau kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang
melalui satu satuan luas penampang per detik.
Serapan
dapat terjadi jika foton/radiasi yang mengenai cuplikan memiliki energi yang
sama dengan energi yang dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan
tenaga. Jika sinar monokromatik dilewatkan melalui suatu lapisan larutan dengan
ketebalan db, maka penurunan intesitas sinar (dl) karena melewati lapisan
larutan tersebut berbanding langsung dengan intensitas radiasi (I), konsentrasi
spesies yang menyerap (c), dan dengan ketebalan lapisan larutan (db). Secara matematis, pernyataan ini dapat
dituliskan :
-dI
= kIcdb
bila
diintergralkan maka diperoleh persamaan ini :
I = I0 e-kbc
dan
bila persamaan di atas diubah menjadi logaritma basis 10, maka akan diperoleh
persamaan :
I
= I0 10-kbc
dimana
: k/2,303 = a , maka persamaan di atas dapa diubah menjadi persamaan :
Log
I0/I = abc atau A = abc (Hukum Lambert-Beer)
dimana
: A= Absorban
a=
absorptivitas
b
= tebal kuvet (cm)
c
= konsentrasi
Bila
Absorbansi (A) dihubungkan dengan Transmittan (T) = I/I0 maka dapat diperoleh
A=log 1/T .
Absorptivitas
(a) merupakan suatu konstanta yang tidak tergantung pada konsentrasi, tebal
kuvet, dan intensitas radiasi yang mengenai larutan sampel. Tetapi tergantung
pada suhu, pelarut, struktur molekul, dan panjang gelombang radiasi.
Pada
Hukum Lambert-Beer, terdapat beberapa batasan, antara lain :
1.
Sinar yang digunakan dianggap monokromatis
2.
Penyerapan terjadi dalam suatu volume yang mempunyai penampang luas yang sama
3.
Senyawa yang menyerap dalam larutan tersebut tidak tergantung terhadap yang
lain dalam larutan
4.
Tidak terjadi peristiwa flouresensi atau fosforisensi
5.
Indeks bias tidak tergantung pada konsentrasi larutan.
Salah
satu hal yang penting juga diingat adalah untuk menganalisis secara
spektrofotometri UV-Vis diperlukan panjang gelombang maksimal. Adapun beberapa
alasan mengapa harus menggunakan panjang gelombang maksimal, yaitu :
1.
Pada panjang gelombang maksimal, kepekaannya juga maksimal karena pada panjang
gelombang maksimal tersebut, perubahan absorbansi untuk setiap konsentrasi
adalah yang paling besar
2.
Di sekitar panjang gelombang maksimal, bentuk kurva absorbansi datar dan pada
kondisi tersebut hukum Lambert-Berr akan terpenuhi
3.
Jika dilakukan pengukuran ulang, maka kesalahan yang disebabkan oleh pemasangan
ulang panjang gelombang akan kecil sekali, ketika digunakan panjang gelombang
maksimal.
Demikian
sekilas tentang Spektrofotometri UV-Vis serta aspek kualitatif dan
kuantitatifnya. Semoga Anda paham terhadap apa yang Saya jelaskan di atas dan
semoga ilmunya bermanfaat. Terakhir, sesuai dengan tujuan Saya menuliskan
artikel ini, Saya mohon doa Kamu agar Saya berhasil memahami materi tentang
spektrofotometri dan bisa lulus dalam mata kuliah Kimia Analisis ini.
